原代心肌細胞培養是體外研究心血管疾病相關機制的主要手段和基本技術。基礎實驗中，與細胞系相比，原代心肌細胞的形態及電生理方面更接近在體細胞，因此，培養原代心肌細胞的質量直接關系實驗的進程及結果。 材料與方法
1.實驗動物和主要試劑
1）新生24h內的SD大鼠10只，雌雄不限；
2）DMEM高糖培養基（CellMax）；
3）胎牛血清（CellMax）；
4）胰蛋白酶（CellMax）；
5）雙抗（CellMax）；
6）D-Hanks；
7）5-溴脫氧尿嘧啶核苷
(5-Bromoo2'-deoxyuridine，5-Brdu)；
8）臺盼藍等。
2.主要實驗儀器
1）高性能無菌超凈臺；
2）CO2培養箱；
3）倒置相差顯微鏡；
4）離心機；
5）恒溫水浴鍋；
6）磁力攪拌器、
7）200目鋼網；
8）血細胞計數器、
9）解剖器械等。
注：
所有手術器械、離心管均高壓滅菌。
玻璃器皿用強酸浸泡過夜，流水沖洗10次，去離子水沖洗3次，烘干后高壓滅菌備用。
3.心肌細胞培養
新生24h內的SD大鼠10只，體積分數為75％的乙醇浸泡消毒2遍，每次約8s。無菌眼科剪沿胸骨正中人剪，盡量避免剪破其他臟器產生污染。用無菌鑷子捏取心臟，迅速置于D-Hanks液中，仔細剝離大血管及多余組織，D-Hanks液反復認真沖洗至少3次，洗去殘留的血細胞及其他雜質。
將心臟剪成約0.5mm×0.5mm×0.5mm的組織塊放人錐形瓶，加入10mL質量分數為0.08％的胰蛋白酶封口，放入37℃水浴鍋中消化，轉子轉速約90~100r·min-1。
第1次消化8min后靜置棄上清。剩余組織進行多次消化，每次2min，收集每次消化后的上清液，直至全部組織消化*。向上清液中加入體積約1/4~1/3的DMEM培養基（含15%的胎牛血清）以終止上清液中殘余胰蛋白酶的消化作用，防止損傷細胞，保證成活率。全部上清液以1200r·min-1離心12min，所得沉淀用約20mL培養基輕輕吹散，用移液管緩慢吹打均勻，細胞懸液經200目孔徑鋼網過濾后移入培養瓶中進行差速貼壁（注意搖勻），55min后取細胞懸液以1000r·min-1離心10min，所得沉淀用培養基（pH=7.2）輕輕吹散。
根據臺盼藍染色結果及細胞計數結果調整細胞密度，以5×108L-1密度接種到培養板或培養瓶中，放入37℃的溫箱中培養，24h后用D-Hanks液或磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗去未貼壁的細胞，可得到視野清晰、密度均勻的貼壁心肌細胞。然后換新鮮培養基繼續培養，72h再次換液，根據細胞生長狀態進行實驗。
4.心肌細胞質量評價
1）心肌細胞觀察
倒置顯微鏡觀察細胞形態、生長狀態、搏動頻率、節律、強度，觀察培養液色澤變化以判斷心肌細胞生長是否良好。
2）臺盼藍拒染法計算細胞活力及細胞純度的鑒定
心肌細胞懸液用等量體積分數為0.4%臺盼藍溶液混勻后用血細胞計數板分別計數活細胞和死細胞數。鏡下死細胞染成藍色，活細胞拒染而呈透亮狀態。
細胞存活率=活細胞數/總細胞數（活細胞＋死細胞）×100%。
用免疫熒光法或通過細胞種板72h后計數搏動心肌細胞百分數測定心肌細胞純度。
心肌細胞免疫熒光鑒定
（1）在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS（0.01M）浸洗3次，每次3min；
（2）用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
（3）0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；
（4）PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫（6%山羊血清，不用BSA，PBS配置）封閉30min；
（5）吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的ACTA1一抗（一抗濃度：1:20，一抗稀釋液：PBS配置）并放入濕盒，4℃孵育過夜；
（6）37度復溫45min，加熒光二抗（二抗換成羊抗兔IgG（H+L)/RBITC,二抗濃度：1:200，二抗稀釋液：PBS配置）：PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min；
注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
（7）復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBS5min×4次洗去多余的DAPI；
（8）用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后激光共聚焦拍照。
結果
1.心肌細胞形態觀察
心肌組織消化后所有心肌細胞均為圓形，培養2~3h部分細胞開始貼壁，12h后可見梭形細胞，細胞逐漸增大，部分貼壁的細胞出現自發性搏動；24h細胞幾乎全部貼壁，可見多角形細胞及較多細胞搏動；48h細胞形態為多角形或梭形，細胞伸出的偽足相互接觸交織成網，逐漸形成細胞簇或細胞單層，鋪滿瓶底。72h后99%以上細胞自律搏動，搏動頻率、節律、強度穩定，頻率70~130次·min-1；大部分細胞相互連接，呈現同步搏動，同一培養瓶中細胞的搏動頻率一致。
24h心肌細胞
48h心肌細胞
2.心肌細胞活力測定結果臺盼藍染色顯示活細胞數>85%。
3.心肌細胞純度測定通過細胞種板72h后計數搏動心肌細胞百分數，所得心肌細胞純度>95%。
4.心肌細胞免疫熒光鑒定結果
心肌細胞（細胞核）
心肌細胞（ACTA1抗體表達）
心肌細胞（合成圖）
討論
1.鼠齡選擇多數文獻推薦1~3d大鼠，新生大鼠在出生后3d內心肌細胞尚未分化，心肌細胞培養時成活率高。
通過大量實驗觀察認為最好選擇出生24h內新生大鼠。
2.無菌操作防止污染是培養細胞成敗的關鍵之一。
常見為細菌、支原體等污染，可導致提取后的細胞不貼壁、不生長、生長后狀態不佳等。要嚴格執行實驗室無菌操作規則且培養基中要加入終濃度為體積分數1%的雙抗液。
3.組織消化反復實驗顯示，0.5mmx0.5mmx0.5mm體積的組織塊更易快速消化且避免長時間消化給細胞帶來損傷。
常用消化液有胰蛋白酶及膠原酶I、Ⅱ等。胰蛋白酶濃度推薦質量分數為0.060%-0.125%，膠原酶質量分數為0.06%-0.10%。
單獨用質量分數為0.08%胰蛋白酶較實用。消化過程應在37℃下進行，用低速磁力攪拌器（80~100r·min-1）或手動搖晃及吹打使酶與組織充分混勻。
4.細胞洗滌;剛消化過的細胞本身附帶消化酶，不利于細胞貼壁，因此，至少要洗滌細胞2~3次。將收集好的上清液加入含體積分數15%胎牛血清的培養基以終止消化，然后離心細胞（1200r·min-1，12min）。
用培養基將離心后沉淀緩和吹散、混勻、過濾后再次離心（1000r·min-1，10min），如此重復1~2次，可洗去黏附細胞的消化酶，有利于細胞貼壁。
5.細胞純化：多選用差速貼壁分離法加化學抑制法。其原理是心臟組織消化后主要有2種細胞，即成纖維細胞和心肌細胞。
由于在培養瓶中大部分成纖維細胞能在短期內貼壁（50~120min），而心肌細胞則需2~24h，因此，通過差速貼壁法能獲得較純的心肌細胞，約95%。差速貼壁分離細胞后，要在培養基中加入5-Brdu，終濃度為0.1mmol·L-1，目的是抑制成纖維細胞的生長。
6.細胞種植：細胞密度約5×108L-1時，72h后可見細胞伸展、接觸，細胞間進行信息交流，形成同步搏動;（1~3）×108L-1時可觀察單個細胞，可見到多種形態的細胞。
種植細胞24h后用磷酸鹽緩沖液或D-Hanks液輕輕洗滌培養板或培養瓶，洗去未貼壁細胞得到可供實驗的理想細胞。
